윤씨의 아버지는 판봉상시사(判奉常寺事) 윤기무(尹起畝)이며, 어머니는 신씨(申氏)이다. 1473년(성종 4) 성종의 후궁으로 간택되면서 숙의(淑儀)에 봉해졌다. 1474년에 왕비(王妃 : 恭惠王后)가 죽은 뒤 숙의 윤씨가 왕의 총애를 받아 계비로 들어온 뒤 원자 융(㦕 : 뒤의 燕山君)을 낳았다.
왕의 총애가 두터워짐에 따라 제빈(諸嬪)을 투기할 뿐만 아니라, 1477년에는 비상을 사용해 왕과 후궁들을 독살하려는 등 갖가지 혐의가 드러나 왕과 인수대비(仁粹大妃)의 미움을 샀다.
급기야 왕의 얼굴에 손톱 자국을 내는 불손한 일까지 있게 되었다. 이에 1479년 많은 신하들의 반대에도 불구하고 좌의정 윤필상(尹弼商) 등의 의논에 따라 폐해 서인(庶人)으로 만들어 친정으로 쫓아보냈다.
그 뒤 신하들이 원자의 어머니를 민간인으로 살게 해서는 안 된다며 조정에서 거처할 곳과 생활비 일체를 지급해줄 것을 주장하였으나 받아들여지지 않았고 오히려 왕의 노여움만 사게 되었다. 윤비는 폐출된 뒤로 밤낮으로 소리내어 우니, 왕도 마음이 움직여 환관으로 하여금 정상을 알아보게 하였다.
이에 인수대비가 환관으로 하여금 윤씨가 화장을 하고 있으며 뉘우침의 빛이 전혀 없더라고 거짓 보고하게 하여, 마침내 1482년(성종 13) 좌승지 이세좌(李世佐)를 보내어 사약으로 자진하게 하였다.
윤씨는 죽음에 이르러 피와 약으로 더럽혀진 수건과 비단 적삼을 남겼다. 원자 융은 당시 4세로서 이 사실을 모르고 자라나 왕위에 올랐다.
1504년(연산군 10) 임사홍(任士洪)이 신수근(愼守勤)과 손을 잡고 부중(府中)의 훈구 세력과 사림파의 잔존 세력을 제거할 계략으로 윤씨의 사사된 시말(始末)을 밀고해 갑자사화를 일으키는 단서로 삼았다.