1552년(명종 7)에 지방 유림의 공의로 정여창(鄭汝昌)의 학문과 덕행을 추모하기 위해 창건하여 위패를 모셨다. 1566년(명종 21)에 ‘남계(藍溪)’라고 사액되었으나, 1597년(선조 30) 정유재란(丁酉再亂)으로 소실되었다. 1603년에 나촌(羅村: 현재 함양군 수동면 우명리 구라마을)으로 옮겨 복원하였다가 1612년 옛 터인 현재의 위치에 중건하였다.
1634년(인조 12) 별사(別祠)를 건립하여 강익(姜翼)을 제향하고 1642년(인조 20) 유호인(兪好仁)과 정온(鄭蘊)을 병향하였다. 그 뒤 1677년(숙종 3)에 정온을, 1689년(숙종 15)에 강익을 본사(本祠) 올려 배향하고, 1820년(순조 20) 정홍서(鄭弘緖)를 별사에 모셨다. 이후 1868년 별사는 훼철(毁撤)되었다. 이 서원은 소수서원(紹修書院)에 이어 두 번째로 창건되었으며, 흥선대원군의 서원철폐령에도 훼철되지 않고 존속한 47개 서원 중 하나이다.
경내 건물로는 사우(祠宇) · 전사청(典祀廳) · 명성당(明誠堂) · 양정재(養正齋) · 보인재(輔仁齋) · 애련헌(愛蓮軒) · 영매헌(詠梅軒) · 풍영루(風咏樓) · 묘정비각(廟庭碑閣) · 고직사(庫直舍) 등이 있다.
사우에는 정여창을 주벽(主壁)으로 하여 좌우에 정온과 강익의 위패가 봉안되어 있다. 명성당은 강당으로 중앙의 마루와 양쪽 협실로 되어 있는데, 왼쪽 협실은 거경재(居敬齋), 오른쪽 협실은 집의재(集義齋)라 하며, 유림의 회합 및 학문의 강론 장소 등으로 사용되었다. 동재(東齋)인 양정재와 서재(西齋)인 보인재에는 각각 연못과 애련헌 · 영매헌이 있다.
이 서원은 1974년 2월 16일 경상남도 유형문화재(현, 유형문화유산)로 지정된 후, 2009년 5월 26일 사적으로 지정되었다. 매년 2월과 8월 중정(中丁)에 향사(享祀)를 지내고 있다. 소장 전적은 『어정오경백편(御定五經百編)』 · 『고려사(高麗史)』 등 59종 317책이 있으며, 재산으로는 전답 1만 4500여 평, 대지 6000평, 임야 1.5정보 등이 있다.
함양의 남계서원은 2019년 7월 “한국의 서원(Seowon, Korean Neo-Confucian Academies)”이라는 명칭으로 다른 8곳의 서원과 더불어 유네스코 세계유산에 등재되었다.