본관은 의령(宜寧). 자는 정경(正卿). 개국공신 충경공(忠景公) 남재(南在)의 5대손으로, 할아버지는 내섬시부정 남칭(南稱)이고, 아버지는 삭녕군수(朔寧郡守) 남변(南忭)이며, 어머니는 이훈(李塤)의 딸이다.
1504년(연산군 10) 사마시에 합격, 1510년(중종 5) 참봉으로서 식년 문과에 을과로 급제하였다.
1514년 정언에 이어 1519년 사간이 되었다. 이때 이항(李沆)·이빈(李笭)·유관(柳灌)과 헌납 유효의(柳孝義) 등이 조광조(趙光祖)가 비록 죄는 있으나 너그럽게 법을 좇도록 왕께 건의하였으나, 남세준은 사간으로서 조광조를 죄줄 것을 요청하였다.
1521년 제용감정·선공감정, 1525년 좌승지·대사헌을 거쳐, 이듬해 왕실의 도(道)를 엄하게 할 것을 건의하고 호조참의가 되었다. 1527년 승지·우승지가 되고 이듬해 예조참판이 되었다. 1529년 한성부우윤·대사헌을 거쳐 1530년 경기감사가 되고, 1531년 예조·이조참판으로 승진하였다.