본관은 성주(星州). 자는 자발(子發), 호는 묵재(默齋)·휴수(休叟). 증조부는 이함녕(李咸寧)[생증조부는 이계령(李繼寧)], 할아버지는 이숙생(李叔生)이다. 아버지는 승문원정자 이윤탁(李允濯)이며, 어머니는 신회(申澮)의 딸이다.
일찍이 중형 이충건(李忠楗)과 더불어 조광조(趙光祖)의 문하에서 학업을 닦고, 1513년(중종 8) 중형과 함께 사마시에 합격하였다. 1519년 기묘사화로 조광조가 화를 입자, 문인들이 화를 염려해 조상하는 자가 없었으나 이문건의 형제는 상례(喪禮)를 다했다 한다.
이에 남곤(南袞)·심정(沈貞)의 미움을 받아, 1521년 안처겸(安處謙)의 옥사에 연루되어 이충건은 청파역(靑坡驛)에 정배되었다가 사사되고, 이문건은 낙안(樂安)에 유배되었다.
1527년(중종 23) 사면되어 이듬해 별시 문과에 병과로 급제, 승정원주서에 발탁되었고, 이어서 승문원박사를 거쳐 정언·이조좌랑에 이르렀다. 그런데 이 때 전날의 혐의로 대간으로부터 서경(署經)이 거부되었으나, 김안로(金安老)의 협조로 관로는 순탄하였다.
1539년 장령을 역임하며 관기 확립에 힘썼고, 그 뒤 통례원우통례(通禮院右通禮)를 거쳐 승문원판교가 되어, 중종의 국상을 맞아 빈전도감(殯殿都監) 낭관으로서 대사를 무난히 처리하였다.
1546년 명종이 즉위하면서 윤원형(尹元衡) 등에 의해 을사사화가 일어나자, 족친 이휘(李輝)가 화를 입었고, 이에 연루되어 성주에 유배되었다가 그곳에서 죽었다.
성품이 근후했고 효성이 지극하였다. 23년 동안 유배 생활을 하면서 오로지 경사(經史)에 탐닉하고 시문에 힘쓰니, 뒤에 이황(李滉)·조식(曺植)·성수침(成守琛)·이이(李珥) 등이 이문건의 시문을 즐겨 읊었다 한다. 괴산의 화암서원(花巖書院)에 제향되었다.