세례명 바오로. 전라북도 진산(지금은 충청남도 금산군에 속함) 출신. 정약용(丁若鏞)의 외사촌이다. 1783년 5월에 생원시에 합격하였다.
1784년(정조 8) 겨울 서울에 머물 때 김범우(金範禹)로부터 처음으로 천주교서적을 빌려보았고, 3년 후 정약전에게서 교리를 배워 입교하였다. 박해가 일어났을 때에도 비밀리에 신앙을 지켜나가던 중 1791년 5월(음력) 어머니 권씨(權氏)의 상을 당하자, 교리를 지키기 위하여 제사를 지내지 아니하고 신주를 불살랐다.
이러한 사실은 곧 친척과 유림에게 알려져 불효자라는 지탄을 받게 되었고, 끝내는 체포 명령이 내려졌다. 윤지충은 사건이 확대되자 충청도 광천으로 피신해 있다가, 숙부가 대신 체포되었다는 소식을 듣고 1791년 11월 21일에 진산 관아에 자수하였다. 진산군수 신사원(申史源)은 여러 가지 말로 회유도 하고 위협도 하였으나, 그는 오히려 교리의 타당함을 주장하여 끝까지 신앙을 고수하였으므로, 그를 따르던 외사촌 권상연(權尙然)과 함께 전주감영으로 이송되었다.
여기에서도 혹독한 고문으로 배교를 강요당하였지만 끝까지 굽히지 아니하므로, 그 해 12월 8일 참수되어 순교하였다. 이 사건이 바로 신해박해 또는 진산사건(珍山事件)이라 불리는 것이다. 2014년 8월 16일 서울 광화문 광장에서 거행된 시복식에서 복자(福者)가 되었다.