본관은 달성(達城). 자는 화익(和益), 호는 죽계(竹溪). 아버지는 문학습독 서진(徐津)이며, 어머니는 부림홍씨(缶林洪氏)이다. 서사원(徐思遠)의 문하에서 수학하였다.
성리학에 잠심(潛心), 궁구(窮究)하고 명리(名利)를 탐내는 마음이 없었다. 정사철(鄭師哲)·손처눌(孫處訥) 등과 도의로 교제하며 향풍(鄕風)의 교화에 힘썼다.
1592년(선조 25) 임진왜란 때 서재겸의 형 서득겸(徐得謙)과 함께 의병을 모집하여 왜적과 싸웠다. 당시 곽재우(郭再祐)가 이끄는 의병들은 화왕산성(火旺山城)에 진을 치고 있었는데 그 곳으로 의병을 이끌고 가는 도중 낙동강 상류인 아금암(牙琴巖)에서 왜적을 만나 접전 끝에 중과부적으로 형 서득겸을 비롯한 많은 의병들이 전사하였다.
그 후 서재겸은 남은 병력을 수습하여 화왕산성의 곽재우 휘하에 들어가 많은 전공을 세웠다. 1697년 정유재란(丁酉再亂) 때에도 서재겸은 팔공산에서 각 지방의 의병장과 회맹(會盟), 적과 끝까지 싸울 것을 결의하였다. 서재겸은 시문에도 능하여 당시에 있었던 일을 시·일기 등으로 기록해 놓았다. 저서로는 『죽계유고(竹溪遺稿)』 3권이 있다.