북장로교 선교사 밀러(Frederick S. Miller)에 의해 1904년 청주에 설립된 장로교회이다. 당시 청주의 지역유지와 젊은이들인 김원배·방흥근·이영준·김재호·이범준 등이 참여하였다. 청주제일교회는 청남학교를 세웠을 뿐 아니라 소민병원과도 협력하면서 청주의 근대화에 이바지하였다.
청주지역의 선교는 북장로교 선교사 밀러가 주도하였다. 1901년 9월 북장로교 선교부로부터 충청도 선교 책임자로 임명받은 밀러는 한국인 전도인 김흥경 등과 함께 청주를 돌며 전도하였고, 여기에 청주의 지역유지와 젊은이들이 이에 가담하였다. 밀러는 이들을 중심으로 1904년 남문밖에 초가집 한 채를 마련하여 청주읍교회를 설립하였고, 또한 교회와 함께 방흥근의 집에서 청남학교도 시작하였다.
교회 설립 1년 만에 교인이 50명을 넘어섰고, 김원배가 임종 유언으로 100원을 기부한 것이 계기가 되어 새 예배당 건축헌금이 시작되었다. 예배당으로 사용하던 초가집에서 그리 멀지 않은 곳에 1,000평이 넘는 넓은 부지가 나왔는데, 그것은 청주진영의 영장 관사 기지였다. 교회는 바로 이곳에 100석 규모의 예배당을 건축하고 청남학교와 아울러 여학교인 청신학교 그리고 시약소(施藥所)를 시작하였다.
이후 청주읍교회는 1914년 200석 규모의 목조 단층 예배당을 마련하였고, 1939년에는 500석 규모의 고딕식 2층 벽돌 예배당을 마련했다.
1939년 건축된 청주제일교회의 고딕식 예배당은 1951년에 다시 증축됨으로써 첨탑 지붕의 중앙 종탑 좌우로 출입구를 냈으며, 외부에서도 바로 2층 예배실로 올라갈 수 있도록 계단을 설치했다. 청주제일교회 마당에는 청주에서 가장 오래된 한글 비석으로 알려진 ‘로간부인기념비’가 있다. 로간(Mary L. Logan) 부인은 1909년부터 10년 동안 청주 지역 여선 선교를 전담했던 선교사였다.