한국에서 최초의 장로교회인 새문안교회는 1887년 9월 27일 14명의 세례교인으로 조직되었다. 그날 장로 두 명이 선정되었는데, 이들은 의주 출신으로 서상륜의 사촌들이었다. 10월 2일 일요일 이들 두 사람이 언더우드(Horace G. Underwood) 목사와 로스(John Ross) 목사로부터 안수를 받았으며, 한국인 한 사람이 추가로 세례를 받았다. 당시 새문안교회의 15명 세례교인들은 모두 서울 거주자들로서 그들 대다수는 의주와 소래 출신 상인들이었다. 1882년 서상륜이 서울에 왔을 때 은밀히 전도할 수 있는 대상은 주1이었으므로 그들 중에서 첫 신자들이 나오게 된 것이다.
새문안교회는 처음에는 정동교회, 정동장로교회 등으로 불리다가 1907년 현재 위치(새문안로 79)로 이전한 후에 1910년 벽돌교회당을 지으면서 새문안교회라는 이름을 얻게 되었다. 이후 1949년 기존 예배당을 300평의 고딕식 건물로 증축하였다가 1972년 779평의 모더니즘 양식의 교회당을 마련하였다.
언더우드와 쿤스(Edwin W. Koons)에 이어 한국인 차재명이 1920년에 담임목사로 부임하여 1941년까지 주2, 그 뒤를 이어 김영주(1944-1950), 강신명(1955-1979), 김동익(1981-1998), 이수영(2000-2016)이 차례로 주3. 일제강점기와 해방 이후 새문안교회는 한국 장로교회의 모교회로서의 위상을 갖고 제반 연합 사업을 주도하였으며, 교회와 사회에 기여한 많은 인물들을 배출하였다.
창립 100주년을 앞두고 1981년에 사업 계획을 설계하여 원일한 · 이한준 · 노정현 · 어윤배 등 11명의 교인들을 필두로 100주년 기념사업준비위원회를 조직하였다. 이후 선교 사업, 역사편찬사업, 새문안 수양관 건립, 새문안 경로원 설립, 새문안 시민도서관 개관, 교회 건물의 보수사업 등을 선정하여 추진했고, 1987년 9월 27일 새문안교회 100주년 기념 예배를 가졌다.
새로운 예배 처소를 위해 2007년 건축위원회를 조직한 새문안교회는 2014년에 구 예배당을 철거하고 2015년에 공사를 시작하여 2019년 최신 양식의 예배당을 준공하였다. 2017년 제7대 담임목사로 이상학 목사가 부임하였다. 2020년 한국교회 부활절 연합예배는 코로나로 인해 새문안교회 대예배실에서 70개 교단 대표들이 참석하여 온라인 영상예배를 드린 바 있다.